Ediciones >> Volumen 22, Nº 74

Septiembre 2015
ISSN 1666-0706

 

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Efecto citotóxico de BisGMA en cultivos celulares de fibroblastos humanos mediante ensayos de MTT

BisGMA cytotoxic effect on cell cultures of human fibroblasts by MTT assays

Autores:
Nicolás Cohn-Inostroza(1), PhD. Pamela Ehrenfeld Slater(2), Francisca Pavicic Rojas(2), Camila De la Rosa Varela(1)

(1) Tesista, Escuela de Odontología, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.
(2) Docente, Laboratorio de Patología, Instituto de Anatomía, Histología y Patología, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Correspondencia e-mail: Nicolás Cohn-Inostroza, nscohn@gmail.com

 

 

RESUMEN

Objetivo: determinar la tasa de muerte celular al exponer fibroblastos humanos (FBH) a concentraciones de BisGMA: 1E-6[M], 6E-5[M], 1E-5[M] y 4,8E-4[M], con el fin de determinar la citotoxicidad de BisGMA presente en materiales de uso odontológico. Material y métodos: las concentraciones de BisGMA se aplicaron en el cultivo FBH durante 24, 48 y 96 horas. La viabilidad celular se determinó mediante ensayos de reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT). Resultados: las concentraciones de BisGMA generan una disminución en la viabilidad celular, de una forma dosis y tiempo dependiente. Conclusión: la disminución de la viabilidad celular es dependiente de la concentración de BisGMA presente en los cultivos celulares.
Palabras Clave: BisGMA, Resinas compuestas dentales, citotoxicidad, fibroblastos humanos, cultivos celulares.

 

ABSTRACT

Objective: To determine the rate of cell death by exposing human fibroblasts (FBH) at BisGMA concentrations: 1E-6 [M], 6E-5 [M], 1E-5 [M] and 4,8E-4 [M]. Methods: BisGMA concentrations were applied in FBH cultivation for 24, 48 and 96 hours. Cell viability was determined by MTT assays. Results: BisGMA concentrations decreased cell viability in a time and dose dependent. Conclusion: decreasing cell viability is dependent on the concentration of BisGMA present in the cell cultures.
Keywords: BisGMA, dental composite resins, cytotoxicity, human fibroblast, cell cultures.

 

INTRODUCCIÓN

Las resinas compuestas dentales son periódicamente utilizadas en el campo de la Odontología, su porcentaje de polimerización fluctúa entre 55% a 75% 1. Es por ello que los monómeros no reaccionados en la red de polímeros, entre los que se cuenta el BisGMA, reducen la longevidad clínica de estas resinas. Estas sustancias pueden penetrar en la dentina llegando a la pulpa, irritar tejidos blandos y promover reacciones alérgicas2. La degradación de los materiales que contienen resinas dentales provoca una reducción de sus propiedades mecánicas. Es igual de importante conocer los procesos de degradación y erosión que ocurren en los materiales que contienen resinas dentales, y las moléculas que se liberan de estos, ya que las resinas dentales pueden estar en permanente contacto con la mucosa oral. Se ha determinado que algunos de los componentes no polimerizados que se hallan insertos en la matriz de las resinas, monómeros/comonómeros como: 2,2-bis [4-(2-hidroxi-3-metacriloyolxipropoxi) fenil] propano (BisGMA) y Bisfenol A, hidroxietilenmetacrilato (HEMA), trietilenglicol dimetacrilato (TEGDMA) y uretano dimetacrilato (UDMA), pueden tener efectos citotóxicos, exoestrogénicos y mutagénicos3-5. Estudios previos describen que los monómeros/comonómeros se liberan desde las resinas compuestas hacia la cavidad oral durante la colocación de la resina y después de la polimerización. Estos compuestos pueden diluirse en la saliva y dirigirse hacia el intestino y metabolizarse formando radicales libres intermediarios6. Otra vía es pasar directamente a la pulpa vital del diente por los túbulos dentinarios mediante difusión y desde allí entrar al torrente sanguíneo, metabolizándose, y formar radicales libres intermediarios. Ratanasathien7 ha realizado un ranking de citotoxicidad de los monómeros no polimerizados: BisGMA > UDMA > TEGDMA >>> HEMA.
Desde los años noventa, Nicolás Olea y diversos autores3-5 han analizado el efecto de estos reactivos no polimerizados mediante test de biocompatibilidad in vitro. Existe un amplio abanico de posibilidades para hacer dicho test, desde modelos en monocapa, como cultivos de fibroblastos humanos y células epiteliales e incluso otros modelos avanzados como el xCELLigence TM (marca registrada) que cuantifica las células8. Pero también hay modelos que simulan mucosa oral como scaffolds celulares, un ejemplo de estos son los realizados en nanofibras de fibroína de seda mediante electrospinning6.
El propósito del presente estudio es determinar la tasa de muerte celular al exponer fibroblastos humanos (FBH) a concentraciones de BisGMA: 1E-6[M], 6E-5[M], 1E-5[M] y 4,8E-4[M], durante 24, 48 y 96 horas.


MATERIAL Y MÉTODOS

Preparación de concentraciones de BisGMA
Las concentraciones de BisGMA seleccionadas para ser suspendidas en el medio de cultivo de 3 ml fueron: 1E-6[M], 6E-5[M], 1E-5[M] y 4,8E-4[M], donde se adicionaron 20μL de la concentración calculada para obtener las concentraciones antes descritas en cada pocillo. Estas fueron preparadas en 1 mL de Etanol 98%, para luego evaporar el etanol usando un baño en agua a 80ºC por dos horas. Luego, se adicionaron 1 ml de agua desionizada, lo que genera una capa de solvatación, hidratando los extremos hidroxilos de la molécula, y posteriormente se sonicó por 30 minutos para asegurar la resolubilización del BisGMA, con el efecto de generar una mezcla homogénea en el medio de cultivo celular.

Obtención y Cultivo de fibroblastos
Los FBH fueron obtenidos en el Laboratorio de Patología, de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile, los cuales fueron obtenidos a partir de explantes de biopsias de piel de pacientes sometidos a cirugía reparadora, dichos pacientes firmaron un consentimiento informado para la donación de dichos explantes. De acuerdo al método de Rheinwald y Green9, utilizando pinzas de disección se procedió a separar la dermis de la epidermis previamente sometidas a tratamiento con tripsina 0,05%; luego, se depositaron trocitos de dermis sobre una placa de cultivo de 100 mm en seco; a continuación a cada explante se agregó una gota de medio Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Gibco, EE.UU.) suplementado con 50% de suero bovino fetal (SFB) (Gibco, EE.UU.), hasta completar 1ml de medio. Este procedimiento se repitió por 3 días, posteriormente se adicionó 1ml de medio DMEM suplementado al 10% más antibióticos; después de una semana, se procedió a cambiar todo el medio y a retirar los fragmentos de dermis adheridos a la placa, este cultivo se lleva hasta completar confluencia y formar una monocapa de células. Todo el cultivo se realizó a 37ºC en atmósfera húmeda y 5% CO2.
En la mayoría de los casos, cuando los cultivos celulares alcanzaron su mayor confluencia (en 4 días), fueron despegados de la botella con 0,25% tripsina-1[mM] EDTA por 3 a 5 minutos y recuperados con lavados en medio Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco, EE.UU.) 10% SFB. Las células fueron contadas y la viabilidad celular se determinó por exclusión de azul tripán. Posteriormente, se realizaron subcultivos en placas de cultivo de 35 mm en iguales condiciones, en una proporción de 2 x 105 células por placa y previo a la estimulación fueron mantenidas por 24 horas en DMEM sin SFB.
Los FBH fueron mantenidos en un medio de cultivos celulares DMEM suplementados con SBF al 10%, Fungizona (HyClone, EE.UU.), insulina (HyClone, EE.UU.), glutamina (HyClone, EE.UU.), gentamicina 10 μg/ml (HyClone, EE.UU.), penicilina 125 μg/ml (Gibco, EE.UU.); los antibióticos fueron adicionados para inhibir el crecimiento de microorganismos y todos los procedimientos fueron realizados de forma aséptica. Todas las incubaciones fueron llevadas a cabo con un 5% de CO2 y 95% de aire a 37ºC. Se llevaron a cabo tripsinizaciones 0,05% tripsina-EDTA (Gibco, EE.UU.). Los FBH se cultivaron en celdas estériles de cultivos de 24 pocillos (Becton Dickinson Labware, NJ, EE.UU.) con 100.000 FBH por pocillo en 3 ml de medio. Se añadió 20 μL de cada concentración de BisGMA calculada para obtener la concentración final deseada por pocillo, en los 3 ml de medio. En 3 placas de 24 pocillos, de estos, en 12 pocillos sembrados con FBH se adicionó BisGMA, obteniéndose las siguientes concentraciones: 1E-6 [M], 6E-5 [M], 1E-5 [M] y 4,8E-4 [M] por pocillo con triplicado de cada concentración de BisGMA. Se usaron seis pocillos como control, separados en dos hileras de tres pocillos cada una localizada en los extremos de la placa, un control contenía DMEM suplementado sin BisGMA, el otro control era DMEM suplementado con BisGMA y sin FBH, además otros seis pocillos como control basal con DMEM sin suplementar con FBH. Cada placa se expuso a solo un determinado tiempo, los cuales fueron: 24, 48 y 96 horas, respectivamente.

Ensayo MTT
El ensayo se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT), utilizando tripsina EDTA se disocian las células y se suspenden en medio de cultivo DMEM suplementado. Se preparó el extracto en Dimetilsulfóxido 0.2 % (Merck, EE.UU.). Se descarta el medio, luego se colocó 100 μL de DMEM sin SBF y se añadieron 50 μL de MTT (mg/ml) en solución tampón fosfato. Se incubaron por 4 horas a 37ºC para permitir la formación de cristales de formazán, luego se eliminó el sobrenadante, se añadió 100 μL de isopropanol y se dejaron los cultivos a temperatura ambiente hasta que los cristales de formazán fueron disueltos. La lectura de densidad óptica (DO) se realizó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm. El porcentaje de Viabilidad se obtuvo de la siguiente forma: % Viabilidad = (DO células tratadas x 100) / (DO células control).
Se recogieron los datos en una planilla online Drive (Google, EE.UU.) y se ordenaron los mismos mediante Epi InfoTM 7.1.5. Para determinar cambios morfológicos en los FBH se fotografiaron las células mediante un microscopio óptico Olympus.

 

RESULTADOS

Cambios morfológicos
Si bien los objetivos del estudio se enfocaron en la viabilidad celular a través de ensayos MTT, morfológicamente visualizamos que ocurre un cambio desde el estrellado reticular a una formación esférica, como también vacuolización y lisis celular (Figura 1), correspondiente a la concentración 4,8E-4 [M] en 48 horas.

Viabilidad celular
En los tiempos de 24, 48 y 96 horas ocurrió citoxicidad celular, excepto en la concentración 1E-6 [M] a las 24 y 96 horas (Figura 2). A las 24 horas, las concentraciones de BisGMA 1E-6 [M] obtuvieron un 114,31% +/- 4,13% de viabilidad, 6E-5 [M] un 90,85% +/- 1,51%, 1E-5 [M] un 84,02% +/- 1,32% y 4,8E-4 [M] un 62,69% +/- 3,23%. A las 48 horas las concentraciones de BisGMA 1E-6 [M] obtuvieron un 91,42% +/- 1,25% de viabilidad, 6E-5 [M] un 61,92% +/- 2,03%, 1E-5 [M] un 51,65% +/- 1,49% y 4,8E-4 [M] un 55,59% +/-2,92%. Y a las 96 horas, las concentraciones de BisGMA 1E-6 [M] un 97,36% +/- 4,84% de viabilidad, 6E-5 [M] un 76,55% +/- 0,81%, 1E-5 [M] un 62,65% +/- 2,37% y 4,8E-4 [M] un 36,46% +/- 2,11%. Con lo cual demostramos que existe una respuesta dosis dependiente a través del tiempo, donde a mayor concentración de BisGMA existe una menor viabilidad celular en concentraciones mayores a 1E-6 [M].

 

DISCUSIÓN

Son numerosas las resinas de uso odontológico que contienen BisGMA, no solo resinas compuestas dentales, sino que también adhesivos, sellantes, cementos dentales, entre otros. Las concentraciones de BisGMA utilizadas en el presente estudio se obtuvieron de un estudio anterior realizado por Cohn-Inostroza y De la Rosa10, que corresponden al estudio de la cinética de liberación de BisGMA desde resinas compuestas dentales en etanol mediante el uso de HPLC, y coincide con la liberación de BisGMA publicada en la literatura11. Si bien existen otros lineamientos para realizar el estudio de la cinética de liberación del BisGMA como el realizado por Kostoryz12, donde analizan la biodegradación enzimática, el objetivo de este estudio fue ir más a fondo, y dilucidar las implicancias celulares, en este caso de FBH, al aplicar el BisGMA en dichos cultivos. Es por ello que determinamos variables morfológicas paralelamente con el ensayo MTT. En este estudio se determinó la viabilidad celular por medio de ensayos MTT, este método es rápido, fácil de realizar y se pueden analizar un gran número de muestras en poco tiempo. El uso de ensayos MTT en la determinación de la citotoxicidad en materiales dentales ha sido utilizado en numerosos estudios13-15. La citotoxicidad de BisGMA en FBH se asocia con la concentración y el tiempo de exposición para concentraciones mayores a 1E-6[M]. Por otro lado, la molécula de BisGMA es considerada de gran tamaño, su peso molecular es de 512.59 gr/mol, altamente hidrofóbica, y no es capaz de penetrar la membrana celular del FBH, pero el FBH en un intento de sobrevivir, vacuoliza la molécula en su citoplasma, generando especies reactivas de oxígeno, que inducen una toxicidad celular mediada por un gran estrés oxidativo, el cual implica numerosas respuestas interrelacionadas, incluyendo la liberación de Ca2+ intracelular, lo que lleva una perturbación del potencial de membrana mitocondrial, generando la muerte celular acompañada de cambios en la integridad de la membrana celular16.
Siguiendo este pensamiento, Ferracane17 menciona que la liberación de las moléculas no polimerizadas en resinas compuestas dentales dependen de:
1. La conversión monómero-polímero, lo cual determina la cantidad de componentes liberados.
2. La composición y los parámetros de solubilidad del solvente con el que se ha realizado la extracción genera una influencia de la cinética de los procesos del mecanismo de la dilución.
3. El tamaño molecular, como las características químicas de las sustancias liberadas, determina la difusión a través de la matriz polimérica de las resinas compuestas dentales.
Desde el punto de vista clínico, aún no se ha asociado directamente el BisGMA o su derivación difenólica como Bisfenol A, en alguna patología sistémica, pero sí se ha asociado como factor de riesgo xenoestrogénico, por el hecho de emular a los receptores de estrógeno y progesterona3, lo que indica su falta de inocuidad y seguridad, ya que se desconoce la totalidad de las vías de señalización bioquímicas que ocurren en el organismo y las consecuencias que pudiesen generar.

 

CONCLUSIÓN


Según los resultados expuestos, para concentraciones inferiores a 1E-6[M] de BisGMA, la citotoxicidad es mínima o nula en los FBH, a concentraciones superiores a 1E-6[M] existe una correlación entre concentración y tiempo de exposición. Esta investigación aporta a la información que respalda la citotoxicidad de las resinas de uso odontológico, pero aún no existe información suficiente que correlacione un efecto clínicamente demostrable.

Agradecimientos
Nuestro agradecimiento al PhD. Ignacio Moreno-Villoslada por su continua guía. Esta investigación está basada en una tesis realizada por Nicolás Cohn Inostroza y Camila De la Rosa Varela, como requerimiento para la obtención del grado académico de Licenciado en Odontología de la Universidad Austral de Chile, junio, 2015.


Declaración de intereses
Los autores declaran que no existen conflictos de intereses.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


1) Moszner N, Ulrich S. New developments of polymeric dental composites. Prog Polym Sci, 2001;26,535–576
2) Tošić G. Occupational hazards in dentistry—part one: allergic reactions to dental restorative materials and latex sensitivity. Work Living Environ Prot. 2004;2:317–24.
3) Olea N, Pulgar R, Pérez P, Olea-Serrano F, Rivas A, Novillo-Fertrell A, et al. Estrogenicity of resin-based composites and sealants used in dentistry. Environ. Health. Perspect, 1996;104(3), 298-305
4) Schafer, Tara E. Estrogenicity of Bisphenol A and Bisphenol A dimethacrylate in vitro. J. Biomed. Mat. Res. 1999; 45(3): 192–197.
5) Kostoryz, E.L. Biocompatibility of Hydroxylated Metabolites of BISGMA and BFDGE. J. Dent. Res. 2003;82(5): 367-371.
6) Wan Q, Rumpf D, Schricker S, et al. Influence of Hyperbranched Multi-methacrylates for Dental Neat Resins on Proliferation of Human Gingival Fibroblasts. Biomacromolecules, 2001, 2(1):217–222
7) Ratanasathien S, Wataha J, Hanks C, Dennison J. Cytotoxic Interactive Effects of Dentin Bonding Components on Mouse Fibroblasts. J. Dent. Res., 1995; 74(9):1602-1606.
8) Urcan, E. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental materials 2010; 26: 51–58.
9) Rheinwald J.G. and Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell 6. 1975: 331-334.
10) Cohn-Inostroza N. and De la Rosa Varela C. Determination of BisGMA release from dental composite resins, Interna J Dent Stud Res, 2014, 2(3):8-16.
11) Fung, E. Y. K., N. O. Ewoldsen, H. S. St. Germain Jr., D. B. Marx, C. Miaw, C. Siew, H. Chou, S. E. Grunniger, and D. M. Meyer. Pharmacookinetics of Bisphenol A Released from a Dental Sealant, J. Am. Dent. Assoc., 2000; 131:51-58.
12) Kostoryz, E. L., Dharmala, K., Ye, Q., Wang, Y., Huber, J., Park, J.-G., Snider, G., Katz, J. L. and Spencer, P. (2009), Enzymatic biodegradation of HEMA/bisGMA adhesives formulated with different water content. J. Biomed. Mater. Res., 88B: 394–401. doi: 10.1002/jbm.b.31095
13) Wada, H. In Vitro Estrogenicity of Resin Composites. J. Dent. Res. 2004; 83(3): 222-226.
14) Ulker, M., Ulker, H. E., Zortuk, M., Bulbul, M., Tuncdemir, A. R., & Bilgin, M. S. Effects of Current Provisional Restoration Materials on the Viability of Fibroblasts. Europ. J. Dentistry, 2009; 3(2):114–119.
15) Mei-Chi C. et cols. The effect of BisGMA on cyclooxygenase-2 expression, PGE2 production and cytotoxicity via reactive oxygen species- and MEK/ERK-dependent and -independent pathways, Biomaterials, 2009; 30(25): 4070-77.
16) Wozniak AL. Xenoestrogens at picomolar to nanomolar concentrations trigger membrane estrogen receptor-alpha-mediated Ca2+ fluxes and prolactin release in GH3/B6 pituitary tumor cells, Environ Health Perspect. 2005; 113(4): 431-9.
17) Ferracane JL. Elution of leachable components from composites. J. Oral Rehabil. 1994; 21:441–52.



Recibido: 30/05/2015 - Aceptado: 31/07/2015